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giovedì 2 settembre 2010

Forse non tutti sanno che: West, North, South & East Blot

Wikipedia riporta alcune interessanti spiegazioni,
Potete trovare links ed incipit nei commenti

Western blot tratto da http://it.wikipedia.org/wiki/Western_blot
Il western blot o immunofissazione o immunoblot è una tecnica biochimica che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici ...

Northern blot tratto da: http://it.wikipedia.org/wiki/Northern_blot
Il Northern blotting è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un campione, in particolare per studiare l'espressione genica. ...

Southern blot tratto da: http://it.wikipedia.org/wiki/Southern_blot
La Southern Blot è una tecnica usata in biologia molecolare per rivelare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela complessa. ...

Eastern blotting tratto da: http://en.wikipedia.org/wiki/Eastern_blotting
Eastern blotting is a technique to analyze proteins, lipids, or glycoconjugates, and is most often used to detect carbohydrate epitopes. Thus, Eastern blotting can be considered an extension of the biochemical technique of western blotting which detects protein post translational modifications (PTM). ...

4 commenti:

Franco Gatti ha detto...

Western blot tratto da http://it.wikipedia.org/wiki/Western_blot
Il western blot o immunofissazione o immunoblot è una tecnica biochimica che permette di identificare una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici; in generale, per facilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (o peso molecolare) utilizzando un gel di poliacrilammide (ma esistono variazioni quali il dot blot o slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni, ma ci si affida alla selettività antigene/anticorpo); successivamente le proteine vengono trasferite su di un supporto, che comunemente è una membrana di nitrocellulosa, e quindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina mediante l'utilizzo di un anticorpo specifico. Recentemente sono state messe a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, evitando quindi il trasferimento su membrana.
Questa tecnica si usa quando il campione corso è composto da una miscela di moltissime proteine tali che con una colorazione standard (blu coomassie o nitrato di argento) non si riuscirebbe a distinguerle l'una dall'altra, oppure quando, pur avendo bande ben distinte (discrete), la proteina di interesse è in quantità troppo basse per essere visualizzata con altre tecniche. Infatti il western possiede tre passaggi in cui avviene l'amplificazione del segnale, ciò rende visibili anche decimi di picomole (10-10mol) di proteina.

Franco Gatti ha detto...

Northern blot tratto da: http://it.wikipedia.org/wiki/Northern_blot
Il Northern blotting è una tecnica che permette di visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un campione, in particolare per studiare l'espressione genica.
Tecnicamente, è simile al Southern Blotting, con la differenza sostanziale che l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in soluzione; per fare in modo che la mobilità elettroforetica sia solo dipendente dalla lunghezza del frammento, l'RNA deve essere preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad alte temperature). Inoltre, la corsa elettroforetica deve essere eseguita in presenza di agenti denaturanti, solitamente formaldeide e formammide. Questa tecnica è stata messa a punto nel 1977 da James Alwine e George Stark della Stanford University.
Il nome è derivato per assonanza dalla tecnica analoga per il DNA (Southern blot).
SEGUE su Wikipedia

Franco Gatti ha detto...

Southern blot tratto da: http://it.wikipedia.org/wiki/Southern_blot
La Southern Blot è una tecnica usata in biologia molecolare per rivelare la presenza di specifiche sequenze di DNA in una miscela complessa. Prende il nome dal suo inventore, Edwin Mellor Southern.
Procedura
Un campione eterogeneo di dna genomico viene trattato con enzimi di restrizione e successivamente sottoposto ad elettroforesi su gel d'agarosio o di poliacrilammide. Nel gel sarà possibile osservare uno smear, ossia una striscia continua; non si vedranno bande nette perché il DNA genomico digerito con l'enzima di restrizione ha tantissimi punti di taglio, quindi sul gel si troveranno tantissimi frammenti che migreranno con velocità diverse in base al diverso peso molecolare.
Il gel viene immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA; solitamente si tratta di una soluzione molto diluita di NaOH per un tempo pari a 15 minuti.
Il gel viene coperto da un foglio di nitrocellulosa e sopra di questo viene posta una pila di fogli assorbenti. Per capillarità la soluzione tenderà ad attraversare il gel, il foglio di nitrocellulosa e risalirà nei fogli assorbenti. I sali trascinano i segmenti di DNA perfettamente in verticale, depositandoli sullo strato di nitrocellulosa con il quale i segmenti instaurano legami elettrostatici. Da notare che in questo passaggio il dna non sale grazie a una forza elettrica come nella prima elettroforesi ma solo per capillarità.
Il foglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e immerso in una soluzione contenente una sonda marcata in vario modo (fluorescenza, radioattività, ecc..) che ibridizza con sequenze di DNA complementari presenti sul foglio, identificandole. La sonda viene creata con tecniche di amplificazione del DNA. L'ibridizzazione della sonda con il DNA può avvenire con diversi gradi di "stringenza" a seconda delle finalità dell'esperimento, consentendo una ibridizzazione con specificità anche inferiore al 100%.
A seguito di lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica che metta in evidenza dove la sonda ha legato il dna genomico.
SEGUE in Wikipedia

Franco Gatti ha detto...

Eastern blotting tratto da: http://en.wikipedia.org/wiki/Eastern_blotting
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Eastern blotting is a technique to analyze proteins, lipids, or glycoconjugates, and is most often used to detect carbohydrate epitopes. Thus, Eastern blotting can be considered an extension of the biochemical technique of western blotting which detects protein post translational modifications (PTM). Multiple techniques have been described by the term Eastern blotting, most use proteins or lipids blotted from SDS-PAGE gel on to a PVDF or nitrocellulose membrane. Transferred proteins are analyzed for post-translational modifications using probes that may detect lipids, carbohydrate, phosphorylation or any other protein modification. Eastern blotting should be used to refer to methods that detect their targets through specific interaction of the PTM and the probe, distinguishing them from a standard Far-western blot. In principle, Eastern blotting is similar to lectin blotting (i.e. detection of carbohydrate epitopes on proteins or lipids); however, the term lectin blotting is more prevalent in the literature.
SEGUE in Wikipedia